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    微生物可行性報告完整版.docx

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    微生物可行性報告完整版.docx

    重組HSV-Ⅱ新型溶瘤病毒疫苗可行性報告 學院生物工程學院 專業班級生工1501班 學生姓名呂永斌 指導教師 裘娟萍 摘要經過重組減毒的Ⅱ型溶瘤單純皰疹病毒在體外具有良好的溶瘤效果,經過研究,目前已經能建立以Vero細胞為基質的重組HSV一Ⅱ病毒疫苗反應器微載體無血清懸浮培養生產工藝,最大病毒滴度可達到6.62 lgTCID50/ml以上。為以Vero細胞為基質的無血清病毒疫苗規模化培養提供了一種簡便、高效的工藝方法,可計劃用于工業化生產。 關鍵詞重組HSV-Ⅱ;Vero細胞;生物反應器;微載體培養 正文 1. 產品的意義目前惡性腫瘤已超過心腦血管類疾病成為首位人類致死性疾病 , 采用Vero細胞培養技術生產的重組溶瘤性Ⅱ型單純皰疹病毒HSV-Ⅱ具有良好的溶源性、靶向性和安全性 , 具有重要的應用價值。國內人類腫瘤疫苗的有關研究處于剛起步狀態,面臨多重難題,建立高效的腫瘤疫苗生產工藝具有非常重要的社會和經濟價值。經過重組減毒的Ⅱ型溶瘤單純皰疹病毒作為高效新型病毒疫苗有望用于腫瘤的臨床研究。 圖1.溶瘤病毒的作用機制 2. 生產材料 ① 細胞培養Vero 細胞 ② 病毒株重組Ⅱ型溶瘤單純皰疹病毒HSVII,中國醫學科學院腫瘤研究所提供。 ③ 微載體 Cytodex 1 ④ 生物反應器 圖2.產品外觀 圖3. Cytodex 1微載體 圖4.Vero細胞 圖5.生物反應器 3. 經濟效益 經查閱ATCC,Vero細胞為免費(不包郵);病毒株需向中國醫學科學院腫瘤研究所申請提供(幾乎免費);微載體Cytodex 1市價為3元/瓶;生物反應器可租借。 成本保守估計(不算設備使用費)每支成本約為6元,預售價為98元,除去設備費和人工生產費,約可凈得利潤30RMB/支(1ml)。 4. 生產工藝流程 圖6.生產車間流程圖 在反應罐培養間中進行重組HSVⅡ病毒疫苗的微載體懸浮培養,步驟如下 ① Cytodex 1微載體制備稱取一定量Cytodex l置于二甲基二氯硅烷硅化的轉瓶/瓶子內,加入PBSpH 7.2水化,比例約為80~150 mL/g Cytodex 1,約3h后將PBS傾去,加入新PBS繼續水化約3 h可過夜,傾去并用新的PBS洗滌一次。高壓滅菌121℃ ,30min,冷卻后傾去PBS,用培養基洗滌一次后傾去,重新加入新鮮培養基置4℃ 冰箱平衡過夜,待用。PBS繼續水化約3 h可過夜,傾去并用新的PBS洗滌一次。高壓滅菌121℃ ,30 min,冷卻后傾去PBS,用培養基洗滌一次后傾去,重新加入新鮮培養基置4C冰箱平衡過夜,待用。 ② Vero細胞的生物反應器培養Cytodex 1濃度為3 g/L,接種密度2O~30 cells/MC,轉速45 r/min,溫度37C,溶解氧濃度DO通過Air,O 和N的進氣比控制在40%空氣飽和度,pH通過調節CO 的進氣量和7.5%w/vNaHCO 控制在7.15~7.2,進行1.5 L/5L反應器培養。 ③ Vero細胞的微載體球轉球轉移培養Vero細胞于轉瓶/反應器內微載體上培養2~4d,待長成單層時,向培養基中加入一定體積的新微載體,與長滿細胞的老微載體按照一定比例混合,進行間歇/連續攪拌培養,待細胞轉移貼附成功后,進行常規連續攪拌培養。 ④ Vero細胞的微載體在位消化轉移培養Vero細胞于轉瓶/反應器內微載體上培養2~4d,待細胞長成單層,即處于指數生長期時,進行在位消化轉移培養。首先停止攪拌,待微載體沉降完全后將培養基排出,用37C溫浴的PBS以約150 ml PBS/g MC的體積洗滌兩次。向微載體內加入37C溫浴的胰蛋白酶含0.02% W/VEDTA 50 ml/g MC緩慢攪拌約2 min后傾去胰酶液,靜止待細胞變圓后,以一定的比例加入含新微載體的培養基,并以一定轉速快速攪拌約2 min后,補足培養基并以35~40 r/min的初始攪拌轉速連續攪拌培養。約培養12 h待細胞在微載體上完全貼附后,將微載體懸液放大到下一級生物反應器內進行培養。 ⑤ 重組HSV-Ⅱ病毒的反應器培養Vero細胞于反應器內微載體上培養2~4d,待細胞生長至80% ~90% 匯合時,接種病毒。接毒時將反應器內培養基排出并用PBS洗滌2次,加入含BSA的無血清病毒維持液VD.LSM,同時將培養溫度由37C降為32%進行病毒培養。待細胞病變至80% ~90%后,將培養液進行4C鹽裂解,收獲病毒。根據計數結果用ReedMunch公式計算TCID50。 ⑥ 待細胞病變后收獲病毒。 5.高效構建技術路線利用病毒活性增效劑(輔助因子)與重組HSVⅡ病毒疫苗共同左右增強產品效力。具體方案如下首先選擇幾種能夠增強病毒活性的增效劑M1,M2,M3,M4,設計實驗選出能夠有效增強該溶瘤病毒的增效劑。設置5個相同的培養基(合適的PH,溫度和滲透壓)放入等量腫瘤細胞作為唯一營養物質,1-4號分別加入相同劑量的M1,M2,M3,M4增效劑,5號加入等量生理鹽水作為對照。放在適宜的環境下培養一定時間后分別對5個培養基中的腫瘤活細胞進行計數,統計并腫瘤活細胞最少的那一組,可以初步得出最佳增效劑。后期反復實驗已確定前面結果的正確,最后選出最佳增效劑并適量加入到溶瘤病毒疫苗中,確認其安全性后投入到臨床應用。 6.產品的質量標準 規格本品為注射劑,1ml/支.每1次人用劑量為1ml,病毒滴度6.00 lgTCID50/ml; 重金屬含重金屬不得超過百萬分之十; 接種部位手臂三角肌肌肉。 無菌檢査依法檢査(通則1101,應符合規定; 重組病毒疫苗的GMP標準 (i) 在工作場所,保護工人遠離生物制劑暴露的風險; (ii) 操作規范,正確謹慎處理轉基因釋放的(微)生物體或生物體含有重組DNA分子; (iii) 保證人或獸用生物制品和藥品的安全性,vero細胞來源的安全性等。 7. 參考文獻 [1]Montagnon B,Fanget B,Nicolas A.The largescale cultivation ofVERO cells in micro-carrier culture for virus vaccine production.Preliminary results for killed poliovirus vaccine.Developments in biological standardization,1981.4755. 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